Úvod / Komentáře RNA INTERFERENCE 
 

"Známe už celou abecedu, tři miliardy písmen genomu, ale co všechno ta písmena jsou schopna vytvořit, jaké zprávy, jaké rušení zpráv, v tom je pořád ještě spousta tajemství. RNA interference je jedním z nich."

Prof. MUDr. Jiří Forejt, DrSc. - Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i., pro ČTK


Koncem roku 2006 získali prestižní Nobelovu cenu za lékařství a fyziologii Andrew Zachary Fire a Craig Cameron Mello. Oba vědci byli oceněni za společný výzkum v oblasti genetiky, který by mohl vést k novým léčbám virových nemocí, rakoviny, kardiovaskulárních chorob nebo i vysokého množství cholesterolu v krvi. Fire a Mello v roce 1998 objevili zásadní mechanismus pro kontrolování toku genetických informací, a to za pomoci upravené ribonukleové kyseliny. Mechanismus přezdívaný "interference kyseliny ribonukleové" neboli RNAi (RNA interference) od té doby testovali.

Fire a Mello

Andrew Zachary Fire se narodil 27.dubna 1959 v Palo Alto v Kalifornii a vyrůstal v nedalekém Sunnyvale. Zde vystudoval Fremont High School a ve studiích pokračoval na University of California v Berkeley, kde získal v roce 1978 titul B.S. (Bachelor of Science, Bakalář) v oboru matematika. V 19. letech odešel studovat na Massachusetts Institute of Technology v Boston, kde získal v roce 1983 pod vedením laureáta Nobelovy ceny Philipa Sharpa titul Ph.D. (Doctor of Philosophy, vědecká hodnost doktora) v oboru biologie. Od nadace Helen Hay Whitney získal stipendium pro postgraduální studium na University of Cambridge v Anglii, kde byl členem týmu MRC Laboratory of Molecular Biology v čele s lauerátem Nobelovy ceny Sydney Brennerem. Strávil zde 3 roky.

Po návratu z Anglie začal pracovat v Carnegie Institution of Washington´s Department of Embryology v Baltimore. Zde působil v letech 1986 až 2003. Právě během působení v Carnegie Labs publikoval první práci zaměřenou na dvoušroubovici RNA jako spouštěče vypínání genů. Začátkem roku 1989 se Fire stal profesorem v Department of Biology na Johns Hopkins University v Baltimore a v roce 2003 se jeho profesionální dráha spojila se Stanford Faculty. Po celou jeho kariéru byla veškerá hlavní práce ve Fire´s lab podporována výzkumnými granty z U.S. National Institutes of Health.

Fire je členem dvou prestižních společností: National Academy of Sciences a American Academy of Arts and Sciences. Působí rovněž v Board of Scientic Counselors a v Center for Biotechnology v National Institutes of Health.

Craig Cameron Mello se narodil 18. října 1960 v New Haven v Connecticatu jako syn paleontologa. Kosti dinosaurů ho přivedly k zájmu o biologii. Navštěvoval Fairfax High School ve Fairfaxu ve Virginii. Během studia koncem 70. let na něj zapůsobila dramaticky se rozvíjející genetika, zejména možnost produkovat inzulín za pomoci genových manipulací s baktériemi. Titul B.S. obdržel na Brown University v roce 1982 a Ph.D. na Harvard University v roce 1990. Poté se stal postgraduálním studentem ve Fred Hutchinson Cancer Research Center v laboratoři Dr. Jamese Priesse v Seattle.

Od roku 1994 je Mello profesorem molekulárního lékařství na University of Massachusetts Medical School (UMMS) ve Worcesteru, ve státě Massachusetts. Poté, co zde získal vlastní laboratoř, se zaměřil na pokusy s "vypínáním" jednotlivých genů u hlístic. Od roku 2000 je členem vědeckém týmu na Howard Hughes Medical Institute.

Náhoda přeje připraveným

Jejich cesta ke slávě, korunované ziskem Nobelovy ceny, začala zmatkem. Fire a Mello nevěřícně zírali na maličké červíky Caenorhabditis elegans zmítající se zvláštními škubavými pohyby. Stejně postižení bývají červíci s poruchou genu kódujícího bílkovinu důležitou pro správné fungování svalů. Fireovi a Mellovi červíci sebou škubali navzdory tomu, že měli příslušný gen v pořádku. Buď došlo při pokusu k chybě, anebo oba biologové narazili na fenomén, který věda dosud neznala. Dalšími pokusy potvrdili druhou možnost. Narazili na evolučně prastarý mechanismus, kterým buňky umlčují geny. Svůj objev zveřejnili v únoru roku 1998 v prestižním vědeckém týdeníku Nature.

Podle klasického genetického dogmatu jsou instrukce pro tvorbu bílkovin nutných k výstavbě i provozu buňky uloženy v dvojité šroubovici DNA (Deoxyribose nucleic acid, Deoxyribonukleová kyselina). Konkrétně v úsecích, jimž říkáme geny. V buněčném jádru se podle generálního plánu DNA vytváří "výrobní výkres" v podobě jednoduché šroubovice RNA (Ribo nucleic acid, Ribonukleová kyselina). Molekuly RNA opustí jádro a v cytoplazmě buňky poslouží jako předloha pro syntézu příslušného bílkovinného řetězce.

RNA připisovaly generace genetiků roli pouhého poslíčka. Fire a Mello ukázali, že je to příslovečná tichá voda, která břehy mele. V roli "divochů" vystupují krátké úseky RNA zformované do dvojité šroubovice. Ty umějí s pomocí specializovaných bílkovinných molekul najít přesně vybranou jednoduchou šroubovici RNA a zajistí její rozsekání na kousky.

Výsledný efekt je podobný, jako kdyby se v dílně dostal výrobní výkres do skartovačky. Podle drobných ústřižků už nikdo nic nevyrobí. Pro "genetickou skartaci" se ujal termín RNA interference. V jejím důsledku mizí z cytoplazmy buněk vybrané molekuly jednoduchých šroubovic molekul RNA a výsledek je stejný, jako kdyby se v jádru buňky podle genu žádná RNA nevytvářela. Gen sice zůstává netknutý, ale buňka se chová, jako kdyby o něj přišla.

To byl také případ škubajících se červíků, kteří tak zaujali Firea a Melloa. Gen pro svalovou bílkovinu měli v pořádku. Vědci jej ale nechtěně umlčeli tím, že červíkům vpíchli krátkou dvojitou šroubovici RNA, která instrukce pro tvorbu svalové bílkoviny zcela "vymazala".

Původně sloužila RNA interference pozemským organismům v boji proti virům. Mnohé viry mívají dědičnou informaci uloženou do dvojité šroubovice RNA. Napadená buňka ji RNA interferencí "sešrotuje" a díky tomu odolá infekci. RNA interference se osvědčila také jako obrana proti tzv. skákajícím genům (transpozóny a retropozóny). Ty mohou napáchat v dědičné informaci zmatek tím, že se vmáčknou do DNA a poškodí tam životně důležitý gen. Později začaly buňky využívat RNA interferenci i k cílenému vypínání a zapínání genů. RNA tak získala vedle úlohy "posla" a "bodyguarda" také funkci "řidiče" dědičné informace.

Jak vlastně RNAi pracuje

Nyní se pokusím podrobněji popsat princip RNAi, který byl nastíněný v předchozím odstavci. Fire a Mello objevili molekuly RNA, které se vymykají dosud panujícímu obrazu RNA jako pasivního "nosiče zpráv". Na rozdíl od "obyčejné" RNA tvořené jediným vláknem, je interferující RNA uspořádána podobně jako DNA do dvojité šroubovice.


Dvojitá šroubovice RNA vzniká podle vlastních genetických instrukcí buňky (A - z DNA se do RNA samy zkopírují genové sekvence, tzv. dsRNA (double-stranded RNA), C - z DNA se do RNA přepisuje záplava kratičkých řetězců tvořených jen 21 až 23 písmeny genetického kódu, tzv. microRNA) nebo do ní přichází z vnějšího prostředí - např. jako dědičná informace některých virů (B). V buňce je působením endonukleázy Dicer rozštěpena na malé úseky čítající 21 až 23 písmen genetického kódu (bází). Tyto fragmenty se označují jako "malé interferující RNA". Používá se pro ně většinou zkratka siRNA (small interfering RNA).


siRNA (A,B,C) dokáže splnit své úlohy jen když se jedno její vlákno spojí s velkým komplexem označovaným jako RISC (RNA-induced silencing complex, což si můžeme do češtiny volně přeložit jako "komplex pro umlčování dědičné informace buzený prostřednictvím RNA"). Malý fragment siRNA spolu s komplexem RISC dosednou na mRNA (messenger RNA, podle těchto buňky vyrábějí bílkoviny) v místě, které odpovídá pořadím bazí sekvencí siRNA. Pro výsledek vzájemné interakce je důležitá míra komplementarity mezi siRNA a cílovou sekvencí mRNA. Pro spojení obou molekul je klíčová komplementarita v přední části siRNA. Pokud zbývající část nemá plnou komplementaritu (obě molekuly RNA do sebe dokonale nezapadají), vytváří se dočasné spojení. mRNA za těchto podmínek není schopna zajistit syntézu proteinu. Jakmile se siRNA od cílové sekvence mRNA zase odpojí, schopnost syntézy proteinu se obnoví. Pokud je ale komplementarita mezi siRNA a cílovou sekvencí mRNA dokonalá, je nastartována tzv. RNA interference. Komplex RISC pak v daném místě začne mRNA štěpit a vyvolá tak její degradaci. Tím je přerušen tok informace podle klasického dogma genetiky. Gen není nijak poškozen, ale z cytoplasmy buňky mizí mRNA a je tak zabráněno syntéze příslušného proteinu. RNA interference je vysoce specifická a zároveň razantní. "Vymazává" jen přesně vybrané mRNA, ale činí to skutečně důkladně.

Gen hlístice Caenorhabditis elegans je umlčen a co dál?

V organismech, jako jsou hlístice Caenorhabditis elegans nebo Drosophila (druh malé mušky), bylo úspěchu dosaženo použitím poměrně dlouhých dsRNA obsahující kódovací sekvence z cílené mRNA.

U savců je situace bohužel komplikovaná výskytem další cesty vzniku dsRNA - reakce na interferon (látka, která má antivirový účinek s velmi rychlým nástupem). Aktivace této cesty, zprostředkovaná primárně receptory (protein umístěný na cytoplazmatické membráně, která se váže na specifické molekuly) na povrchu buňky a cytoplazmatickou RPK ( RNA-depend Protein Kinase), vede k deregulaci proteinové syntézy, případně má za následek apoptózu (mechanismus kontrolované buněčné smrti).

Problém lze řešit použitím krátké dsRNA napodobující siRNA a (nebo) microRNA. Když se takové dsRNA použijí jako spouštěcí činitelé, ve většině případů poskytnou silné specifické RNAi reakce schopné reprodukce, bez prokazatelné interferonové aktivace.

Úspěch této základní metodiky vedl k rychlému převzetí RNAi jako nové metody cíleného umlčování genů v široce rozmanitých pokusných systémech od Caenorhabditis elegans až po lidské buňky. To mělo za následek rychlý pokrok návrhu spouštěcích molekul a testování stále více ambiciózních aplikací základních technologií.

Závěr

Je zřejmé, že objev amerických vědců je průlomový. Otevřel cestu k cílenému umlčování genů pro potřeby medicíny. Jak dlouhá cesta povede k využití poznatku v lékařské praxi, záleží na mravenčí práci vědců, kteří ve svých laboratořích poznatky o RNAi široce používají při studiu fungování mnoha živých organismů. Fire a Mello tuto cestu otevřeli a dali tak naději na vyléčení mnoha vážně nemocným. S určitostí však lze už nyní říci, že RNAi způsobila revoluci ve výzkumu v laboratořích po celém světě. Zatímco vědci z UMMS se plně věnují výzkumu léčby rozmanitých nemocí s využitím výhod RNAi technologie, 49 předních farmaceutických společností zakoupilo licenci na RNAi technologii od UMMS a Carnegie Institution a zabývají se vývojem produktů a služeb založených na RNAi technologiích.

Seznam použité literatury

01. ADAMS, Amy; The ABCs of RNA; MedNews, Stanford School of Medicine, 10. dubna 2006, Dostupné na internetu:
http://mednews.stanford.edu/fire/fire-primer.html.
02. ADAMS, Amy; Secret life of RNA; Stanford Medicine Magazine, Winter 2005, Dostupné na internetu:
http://mednews.stanford.edu/stanmed/2005winter/rna.html.
03. ČTK; Nobelovu cenu za lékařství dostali Američané Fire a Mello; MediPol, MED-MEDIA s.r.o., 2. října 2006. Dostupné na internetu:
http://www.medipool.cz/index.asp?param=C&ID=2864.
04. FIRE, Andrew Z.; XU, SiQun; MONTGOMERY, Mary K.; KOSTAS, Steven A.; DRIVER, Samuel E.; MELLO, Craig C.; Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans; Nature, Macmillan Publishers Ltd., Vol.391, No.6669, 19. února 1998, str. 806-811.
05. KLEIBL, Zdeněk; Apoptóza; Přednáška, Ústav biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK v Praze, 2006, str. 2. Dostupné na internetu:
http://bexo.lf1.cuni.cz/Studenti/Texty/ Apoptoza2006.pdf
06. MALLERY, Charles; How siRNA Works; University of Miami, D. of Biology, 13. června 2006, Dostupné na internetu:
http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/how_siRNA_works.htm.
07. Novák, Jan; Nobelova cena za naději pro nemocné; iHNed.cz, ECONOMIA a.s., 10. října 2006. Dostupné na internetu:
http://vzdelavani.ihned.cz/3-19489140-nobelovu+cenu-d00000_d-5c.
08. PAZDERA, Josef; Interferon a slintavka; osel.cz; ISSN 1214-6307, 22. ledna 2003, Dostupné na internetu:
http://www.osel.cz/index.php?obsah=6&clanek=206.
09. PETR, Jaroslav; MikroRNA se podílí na vzniku zhoubných nádorů; Medical Tribune, Číslo 12/2005, 18. července 2005, str. 3.
10. PETR, Jaroslav; Nobelovu cenu za lékařství dostali Američané; lidovky.cz, Lidové noviny a.s., 2. října 2006. Dostupné na internetu:
http://lidovky.zpravy.cz/nobelovu-cenu-za-lekarstvi-dostali-americane-fnv-/ln_veda.asp?c=A061002_121257_ln_veda_svo.
11. POSPÍŠILOVÁ, Šárka; RNA interference (RNAi) - nová technologie utlumení exprese fúzních genů; Přednáška, XVIII. Olomoucké hematologické dny, 2004. Dostupné na internetu:
http://olhemdny.cz/abstrakta/bysection.php?year[rocnik]=2004&abstracts[sekce]=8.
12. REUTERS; Američané získali Nobelovku za genetický výzkum; iDNES.cz, MAFRA a.s., 2. října 2006. Dostupné na internetu:
http://zpravy.idnes.cz/americane-ziskali-nobelovku-za-geneticky -vyzkum-f68-/vedatech.asp?c=A061002_115640_vedatech_miz.
13. RNAi WEB. Dostupné na internetu:
http://www.rnaiweb.com/.
14. SANAK, Marek; Nagroda Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny za rok 2006; Medycyna Praktyczna - portal dla lekarzy, Medycyna Praktyczna, 6. prosince 2006. Dostupné na internetu:
http://www.mp.pl/artykuly/index.php?aid=30363&_tc=6D4610BA2A044C12895B8B74380D8E84
15. SMP RNAi / NGRN; RNAi Mechanism; SNP RNAi, National Genome Reasearch Network. Dostupné na internetu:
http://www.rnai.ngfn.de/index_431.htm.
16. STANFORD UNIVERSITY SCHOOL OF MEDICINE; Andrew Fire´s Research; Official Page/Publication of the Stanford University School of Medicine. Dostupné na internetu:
http://med.stanford.edu/profiles/frdActionServlet?choiceId=facProfile&fid=3989
17. THAKUR, Archana; RNA interference revolution; Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458, universidad Católica de Velparaiso - Chile, Vol.6, No.1, 13. května 2003., str. 39-49.
18. THE NOBEL FOUNDATION; The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006; The Official Web Site of the Nobel Foundation. Dostupné na internetu:
http://nobelprize.org/nobel_prizes/ medicine/laureates/2006/.
19. TUČEK, Josef; Nobelova cena za zničená vlákna; aktuálně.cz, NetCentrum s.r.o., 2. října 2006. Dostupné na internetu:
http://aktualne.centrum.cz/clanek.phtml?id=250362.
20. UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS; Craig Mello´s Research; Official Page/Publication of the University of Massachusetts. Dostupné na internetu:
http://www.umassmed.edu/pmm/ faculty/mello.cfm.
21. UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS; RNAi: A Scientific Tool With Broad Applications; Research Enterprise at the University of Massachusetts Medical School, Fourth Edition. Dostupné na internetu:
http://www.umassmed.edu/uploadedfiles/UMASS_ResEnterprise.pdf.
22. URBAN, Tomáš; VYHNÁNEK, Tomáš; Virtuální svět genetiky 1; Skriptum ISBN: 80-7157-613-1, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2006, str. 107.
23. WADE, Nicholas; 2 American ´Worm People´ Win Nobel for RNA Work; The New York Times, The New York Times Company, 3. října 2006. Dostupné na internetu:
http://www.nytimes.com/2006/10/03/science/03nobel.html.
24. WEISS, Rick; 2 U.S. Scientists Share Nobel; The Washington Post, The Washington Post Company, 3. října 2006. Dostupné na internetu: http://www.washingtonpost.com/wp-dyn/content/article/2006/10/02/AR2006100200185_pf.html.
25. WIKIPEDIA - THE FREE ENCYCLOPEDIA; Andrew Fire; Wikimedia Foundation Inc.. Dostupné na internetu:
http://en.wikipedia.org/wiki/Andrew_Fire.
26. WIKIPEDIA - THE FREE ENCYCLOPEDIA; Craig Mello; Wikimedia Foundation Inc.. Dostupné na internetu:
http://en.wikipedia.org/wiki/Craig_C._Mello.
27. WIKIPEDIA - THE FREE ENCYCLOPEDIA; Receptor; Wikimedia Foundation Inc.. Dostupné na internetu:
http://en.wikipedia.org/wiki/Receptor_%28biochemistry%29.
28. WIKIPEDIA - THE FREE ENCYCLOPEDIA; RNA interference; Wikimedia Foundation Inc.. Dostupné na internetu:
http://en.wikipedia.org/wiki/RNAi.

Alena Řehůřková
11. března 2007 (16:51)